【技能实训13】牛胚胎非手术回收操作技术

一、实训目的

通过技能实训，掌握母牛的胚胎非手术回收操作技术。

二、实训准备

（1）一次性无菌口罩、帽子，指甲剪等。牛用的开张器、输精枪，细管冻精。

（2）非手术回收（牛）：工作服、胶靴、长臂手套（胚胎回收人员用），供体牛外阴清洗剂、消毒剂，子宫颈扩张棒、子宫颈粘液去除器外套与钢芯，胚胎回收三通管，胚胎回收二通管（进子宫角，与外部三通管连接，注意区分青年牛和经产牛型号）、胚胎回收二通管钢芯、冲胚液配制试剂或商品化冲胚液、过滤式集卵杯（牛用），1000mL量筒，封口膜等。

（3）酒精棉球、液态石蜡、肥皂、0.3％的高锰酸钾或2％新洁尔灭。

三、方法步骤

（一）胚胎回收的概念

胚胎回收，也称采卵，就是在超数排卵动物发情配种后一定时间把受精卵或早期胚胎从超排配种动物的生殖道中冲洗出来，经过胚胎检出、质量鉴定，确认质量合格后，供胚胎移植、性别鉴定后移植、冷冻保存或作为胚胎工程技术研究的材料。

（二）胚胎回收方法

因动物种类不同，卵母细胞的受精、受精卵卵裂和早期胚胎发育日程会有所差异，所以配种后胚胎回收时间也不相同；同一种动物配种后胚胎回收时间可依据所需要的胚胎发育阶段来确定，胚胎发育阶段的不同也决定了所处生殖器官位置不同，需采用适用于相应生殖器官位置的胚胎回收操作方法。

1.胚胎非手术回收法

胚胎非手术回收法就是指借助胚胎非手术回收器械，经阴道和子宫颈回收子宫角胚胎的方法。

胚胎非手术回收用于牛、马等可以经直肠进行子宫颈和子宫角操作的动物，胚胎移植实践中常用于牛的子宫角胚胎回收。

2.胚胎非手术回收时间

胚胎非手术回收应在超数排卵母牛发情配种后6～8d，从子宫角回收桑葚胚或早期囊胚。

牛的胚胎发育进程如表8-3所示。

表8-3　牛的胚胎发育进程

（三）胚胎非手术回收基本条件和物品准备

1.移植场所

胚胎非手术回收需要有满足胚胎非手术回收工作需要的基本条件，主要包括胚胎非手术回收与移植室和胚胎操作室。

其中胚胎非手术回收与移植室为胚胎回收和移植专用，要求地面防滑，便于保持清洁和消毒，设有保定栏，与胚胎无菌操作室之间安装传递窗，室内温度不低于15℃；胚胎无菌操作室为胚胎操作专用，保持无菌无尘，室内温度保持在25℃左右。

2.移植环境

在牛的生产性胚胎移植实践中，在保证胚胎无菌操作的前提下，可以利用现有条件进行胚胎回收。

有条件的胚胎移植单位或者专门从事胚胎移植的企业，可以按照生产现场胚胎移植要求配备移动式胚胎移植实验室，即胚胎移植车。

3.移植设备

胚胎移植主要设备、器材与药品、试剂目录准备胚胎非手术回收所需物品。

其中胚胎非手术回收专用配套器材的准备工作尤为重要，主要包括子宫颈黏液去除器外套与钢芯，子宫角胚胎回收管与钢芯，注射器（给子宫角胚胎回收管气囊注入空气用），三通管（Y型），冲胚液。冲胚液收集容器（如1000mL量筒）或过滤式集卵杯（牛用）及其滤出冲胚液的收集容器等。

（1）子宫角胚胎回收管。子宫角胚胎回收管为子宫角胚胎回收专用器材，使用时注意区分适用于青年牛和经产牛使用的型号（青年牛一般使用16#～18#，经产母牛一般用20#）。

①子宫角胚胎回收管为二通管，包括冲胚液注入与流出通路和气囊送气与放气通路。

冲胚液注入与流出通路为新鲜冲胚液注入子宫和子宫回流冲胚液流出的通路，与外部的三通管相连。回收管前部有包裹在冲胚液注入与流出通路外围的气囊，与后端的送气通路相连通，胚胎回收时给气囊注入空气使气囊充盈，充入空气的气囊可以固定胚胎回收管，并避免注入子宫腔前端的冲胚液以及悬浮在冲胚液中的胚胎流向子宫腔后端，使回流冲胚液只能回流到体外与胚胎回收管相连的集卵杯中。胚胎回收结束时抽出气囊的空气气囊恢复未充气状态，便于从子宫角拔出。

②子宫角胚胎回收三通管（Y型）与子宫角胚胎回收管连接，包括子宫角胚胎回收管接口，冲胚液接口和集卵杯接口，使用时分别与冲胚液、子宫角胚胎回收管和集卵杯连接。

③过滤式集卵杯使用时与三通管的专用接口相接，含胚胎的回流冲胚液流入集卵杯时，由于集卵杯侧壁设计了两个尼龙网窗口，尼龙网的网孔小于胚胎直径，多余的冲胚液可经尼龙网窗口外溢，而胚胎则保留在尼龙网窗口内侧，也就是集卵杯内，这样可以较大程度地减少胚胎检出时的冲胚液体积。

（2）冲胚液。胚胎非手术回收常用冲胚液（也有人称为冲卵液）为含有2％～5％灭活胎牛血清的改良杜氏磷酸盐缓冲液或商品化冲胚液，使用前加热到37℃左右。

配制冲胚液所用的试剂、胎牛血清和抗生素应符合要求（试剂目录上明确说明该试剂符合组织培养要求）；胎牛血清使用前需经过质量检测，无菌、无支原体、无病毒和内毒素，肉眼观察呈淡黄色、澄清透明、无杂质，说明书或标签应载明是否经过灭火处理，未灭火血清须经灭火处理（56℃水浴30min），-20℃～-70℃保存，用前解冻并过滤。

（三）胚胎非手术回收动物准备

1.动物禁食

牛的胚胎非手术回收前，需对动物禁食24h以上，以减轻腹压和瘤胃的压力对非手术回收操作的影响。

2.动物的保定

将母牛站立保定，掏净直肠内的粪便，检查双侧卵巢上的黄体数量（以便统计胚胎回收率）。

3.动物的麻醉

硬膜外腔麻醉：将母牛站立保定，掏净直肠内的粪便，检查双侧卵巢上的黄体数量（以便统计胚胎回收率）。

用2％普鲁卡因或利多卡因5mL左右，在荐椎与第一尾椎间（荐尾间隙）或第一、第二尾椎间，实施硬膜外腔麻醉，使后躯和骨盆腔器官松弛。应注意麻醉剂使用剂量不宜过大，以免引起牛的后躯过度松弛而卧倒。

4.外阴清洗、消毒

麻醉后将牛尾拴系在牛体一侧，用清水进行会阴部和外阴周围清洗，再用0.1％新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液或0.1％高锰酸钾溶液冲洗消毒液充分、彻底洗洁母牛后躯，用灭菌纸巾擦干，最后用酒精棉球擦拭消毒外阴部。

5.子宫颈黏液去除器

为便于插入胚胎回收管，用子宫颈黏液去除器吸除子宫颈黏液。

对青年母牛或子宫颈通过困难的母牛，可先用子宫颈扩张棒扩张子宫颈，再吸除子宫颈黏液。

（四）胚胎非手术回收操作步骤

1.插入子宫角胚胎回收管

采卵管的导入：在二路采卵管内插入不锈钢内芯使之挺直，将挺直的采卵管导入阴道达阴道穹窿，另一只手在直肠内协助。慢慢将导管插入子宫体，到子宫角内5cm左右，拔出采卵管内的内芯约2cm，再使采卵管沿子宫角弯曲方向进入子宫角深部。在这一过程中，助手每抽出约2cm的内芯，术者将采卵管向子宫内送入相应的长度，直到将采卵管送到子宫角适当的位置。

插入子宫角胚胎回收管时。术者通过直肠把握，将带有钢芯（保持回收管硬度）的子宫角胚胎回收管经过母牛阴道和子宫颈送入一侧子宫角大弯处。

2.抽出钢芯

将钢芯稍微向后抽出，再将胚胎回收管送到子宫角大弯前至小弯基部，整个操作过程注意轻巧操作避免损伤生殖道。

3.利用气囊固定子宫角胚胎回收管

采卵管中的一路为“气路”，即通过它向气球内充气；另一路为“水路”，即向子宫内灌注和回收冲卵液。胚胎回收管前端插入子宫角前端小弯基部后，利用注射器通过胚胎回收管后端的送气管向回收管前端的气囊慢慢送入空气，并根据母牛年龄、是否经产及子宫角大小和胚胎回收管的送入深度确定充气量，一般青年牛充气8～10mL，经产牛12～15mL。

4.利用气囊固定子宫角胚胎回收管

给气囊送入空气一般由胚胎回收助手进行，充气时先用注射器一次推入最终充其量的三分之二左右，然后按术者在直肠内对胚胎回收管气囊部位的感觉而发出的指令，以1mL为单位继续充气，直到充入合适体积的空气。充气后的气球可将子宫角固定于子宫角大弯附近。充气结束后，封闭送气管，将采卵管内的不锈钢内芯全部抽出。

5.子宫角胚胎冲洗

（1）子宫角胚胎回收管固定后，开始子宫角胚胎冲洗。胚胎冲洗时，将冲胚液容器挂在高于外阴部1m处，通过三通管的三个接口分别连接冲胚液、集卯杯子宫角胚胎回收管。

（2）确认各部件连接妥当后，通过胚胎回收管的冲胚液进液管缓慢向子宫内灌注冲胚液。由于牛的宫管接合部没有明显的括约肌，当子宫内注入液体而子宫角压力增大时，液体和胚胎有可能经宫管接合部进入输卵管，而造成胚胎回收失败。因而在刚开始灌注冲胚液时，一次注入的冲胚液体积不宜太大，一般以20～30mL为宜，同时要注意缓慢注入，注入冲胚液后由术者通过直肠把握、对子宫角前端轻轻按摩，之后打开与胚胎回收管相接的冲胚液回流管使子宫内的冲胚液连同胚胎流出、收集到过滤式集卯杯或其他集卵容器（如1000mL量筒）中。之后逐渐加大注入冲胚液的体积、反复冲洗子宫角，每次冲胚液注入量为30～50mL，单侧子宫角冲胚液总量为300～500mL。

在子宫角反复冲洗过程中，可以将胚胎回收管向后分次退回并逐渐增加气囊充气量（退回前抽出气囊内空气、向后移动后重新注入空气）。

（3）子宫角胚胎冲洗。

①一侧子宫角冲洗完毕后，放出气囊中的空气，重新安装钢芯，将胚胎回收管退回到子宫体位置，送入另一侧子宫角，重复上述子宫角冲洗操作。

②可以使用两个50mL注射器，代替上述灌注式胚胎冲洗方法，不再使用三通管、冲胚液袋（或冲胚液瓶），而使用两个抽满冲胚液的注射器交替缓慢注入和抽回冲胚液进行子宫角胚胎冲洗，冲胚液注入量和操作程序与灌注式胚胎冲洗方法类似。

（五）冲洗后的子宫处理

向子宫内注入抗生素溶液（青霉素80万单位和链霉素100万单位）或0.1％～0.2％的碘甘油溶液。同时肌肉注射氯前列醇或氯前列醇钠0.4mg，胚胎回收2天后再注射一次。回收的冲胚液立即送入胚胎无菌操作室静置后，进行胚胎检出和质量鉴定。

（六）胚胎质量检测

1.A级

胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，结构紧凑，色调和透明度适中，胚胎细胞团呈均匀对称球形，胚胎发育阶段与预期发育阶段一致。透明带光滑，不规则的细胞相对较少，变性细胞不高于10％。

2.B级

轮廓清晰，色调及细胞密度良好，胚胎细胞团的大小和形状以及细胞的颜色和密度存在一定的不规则，有小部分游离细胞，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段基本一致，变性细胞的比例为10％～20％。

3.C级

胚胎细胞团的大小、形状及细胞颜色和密度存在严重不规则。轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或泡液较多，变性细胞的比例为30％～40％。

4.退化

死亡或退化的胚胎，有碎片，轮廓不清晰，结构松散，变性细胞比例高于50％。

冲胚完毕后，接触母牛站立保定。

四、实训提示

（1）全程佩戴无菌手套、口罩及帽子；外阴消毒需彻底；所有器械使用前用酒精擦拭或高压灭菌，避免子宫感染。

（2）插入时保持钢芯挺直，抵达子宫角大弯后抽出钢芯2cm再深入；退管前需先放空气囊，避免拉扯损伤子宫内膜。

五、实训报告

（1）写出给牛的胚胎非手术回收的过程。

（2）如何判断胚胎质量。