第四节　精液保存

精液稀释后即可进行保存。通过保存，可延长精子在体外的存活时间，便于使用和运输。现行的精液保存方式有3种，即常温（15～25℃）保存、低温（0～5℃）保存和冷冻（-196～-79℃）保存。常温和低温保存是液态，故称液态保存。

一、精液的常温保存

常温保存的温度在15～25℃之间，温度允许有一定变动，所以又称为变温保存或室温保存。常温保存不需要特殊设备，简单易行，便于普及和推广，适用于各种动物精液的短期保存，尤其适合公猪精液的保存。

（一）原理

精子在弱酸性环境中，其活动受到抑制，能量消耗减少，而pH一旦恢复到中性，精子活力即可复苏。因此，可在稀释液中加入弱酸性物质（如己酸），把pH调整到6.35左右，从而抑制精子的活动，达到短期保存精液的目的。不同酸类物质对精子产生的抑制区域和保护效果不同，一般认为有机酸好于无机酸。亦可向稀释液内充入一定量的CO₂气体，溶入水形成碳酸，变成弱酸性环境。

（二）方法

（1）向稀释液中充入二氧化碳，如伊利尼变温稀释液（IVT）。

（2）利用精子本身在代谢中产酸，自行调节pH，如康奈尔大学稀释液（CUE）。

（3）向稀释液中加入有机酸，如己酸稀释液（CME）。

常温保存的稀释液除降低pH使精子代谢减慢外，还依靠给精子补充足够的养分，同时加入抗菌物质以抑制细菌的滋生。有的还在稀释液中加入缓冲物质；有的加入明胶以阻止精子运动。

二、精液低温保存

（一）原理

在体温状态下，精子的代谢正常；当温度降低时，精子的代谢活动减慢；当温度降至0～5℃，精子的代谢较弱，几乎处于休眠状态。此时精子的物质代谢和能量代谢均降到较低水平，废物累积减少，且此温下不利于微生物的繁殖，故可达到保存目的。当温度回升后，精子又逐渐恢复正常的代谢机能而不丧失其受精能力。

（二）方法

精液进行低温保存时，应采取逐步降温的方法，并使用含卵黄的稀释液，以防冷休克。首先把稀释后的精液按一个输精量（一个输精量因畜禽种类、品种、精液类型不同而有所差异）分装至一个容器中，封口，再包以数层棉花或纱布，最外层用塑料袋扎紧，防止水分渗入。把包装好的精液放到0～5℃的低温环境中，经1～2h，精液即降至0～5℃。在保存过程中，要维持温度的恒定，防止升温。如遇特殊情况或运输可用广口保温瓶进行，在保温瓶中加7～8成满的冰块，把包装好的精液放在冰块上盖好，注意定期添加冰块。若无冰源，可采用化学致冷法，在冷水中加入一定量的氯化铵或尿素，可使水温达到2～4℃。

三、精液冷冻保存

精液冷冻保存是利用液氮（-196℃）或干冰（-79℃）作冷源，将精液处理后冷冻起来，达到长期保存的目的。精液冷冻保存是人工授精工作的一大进步，由于保存时间的延长，使精液的使用不受时间和地区的限制，从而加快了家畜品种的育成和改良速度。目前，牛的冷冻精液在生产上的普及率已达到100％。

（一）精液冷冻保存的原理

精子在超低温下，其代谢几乎停止，以生命相对静止的状态保存下来，当温度回升后，又能复苏且具有受精能力。其理论依据是玻璃化假说和甘油保护学说。

1.玻璃化假说

物质的存在形式有气态、液态和固态，其中固态又分为结晶态和玻璃态。在不同的温度条件下，这两种形式可以相互转化。

（1）结晶态。当精液的温度由冰点（0℃）逐渐降到-60℃左右时，精液中的水分由液态变成固态，其结构按几何图式进行有序排列，冰晶颗粒大而均匀，叫作结晶态或冰晶化。精液在形成结晶态时，由于缓慢降温，精清中的水逐渐形成冰碴儿，精子被排斥到没有冻结的那部分精液中，形成高渗液，造成精子内外渗透压差距增大，使精子失水干涸而死亡；同时由于冰晶在扩展移动中，对精子产生机械压力，破坏精子原生质表层和内部结构，也可引起精子死亡。因此，缓慢降温形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。

（2）玻璃态。玻璃态指当精液由低温骤然降到-60℃以下，精液变成固态时，其结构图式进行无序排列，冰晶颗粒细小而均匀，叫作玻璃态（化）。精液在形成玻璃化时，由于快速降温，精清中的水分，在精子周围迅速形成一层玻璃化膜，将精子保护起来，同时使精子迅速进入休眠状态；当解冻快速升温时，则玻璃态又可跨越结晶态直接变为液态，使精子复苏而恢复受精能力。

经试验证明，在0～60℃是冰晶形成的温度区域，而且在逐渐降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶形成越大，以-15～25℃为甚。玻璃化必须在-60～-250℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而形成。

2.甘油保护学说

快速降温可使精液跨越结晶态进入玻璃态，但急剧降温会造成精子冷休克。研究表明，向稀释液中添加甘油，不但可增强精子的抗冻能力，而且可防止冰晶化和精子冷休克。

甘油又名丙三醇，为高热能物质。其3个羟基（OH）为亲水基团，可与精液中的水结合，限制和干扰水分子的晶格排列而产生冰晶；其烃链为疏水基团，朝向精子，可阻止精子的内外水分相互渗透，从而使精子保护在玻璃化膜中。

但是，甘油浓度高时，对精子有危害作用，应掌握甘油的用量。一般牛冷冻精液中甘油通常加入5％～7％。

除甘油外，其他多羟化合物如二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷、糖类等都具有抗冻作用。

（二）精液冷冻技术

精液冷冻技术已普及，现以牛精液冷冻为例，叙述精液冷冻制作技术。

1.采精及精液品质检查

精液冷冻效果与精液品质密切相关。做好采精前的准备和操作，争取获得优质的精液。

2.精液稀释

根据冻精的种类、分装剂型和稀释倍数的不同，精液的稀释方法也不尽一致，现生产中多采用一次或两次稀释法。

（1）一次稀释法。将含有甘油、卵黄等的稀释液按一定比例加入精液中，适合于低倍稀释。

（2）两次稀释法。为避免甘油与精子接触时间过长而造成的危害，采用两次稀释法较为合理。首先用不含甘油的稀释液（第一液）对精子进行最后稀释倍数的半倍稀释，然后把该精液连同第二液一起降温至0～5℃（全程1h左右），并在此温下做第二次稀释。

3.降温平衡

采用一次稀释法，由于稀释温度为30℃，需经1～2h缓慢降温至0～5℃，以防冷休克的发生。平衡是降温后，把稀释后的精液放置在0～5℃的环境中停留2～4h，使甘油充分渗入精子内部，起到膜内保护剂作用的过程。

4.精液的分装

现行冻精常采用颗粒、细管和袋装等分装方法。

（1）颗粒冻精。将精液滴冻在经液氮致冷的金属网或塑料板上，冷冻后制成0.1mL左右的颗粒。颗粒冻精曾在牛中被广泛应用，现多用于马、绵羊及野生动物的冻精剂型，具有成本低、制作方便等优点，但不易标记，解冻麻烦，易受污染。

（2）细管冻精。把平衡后的精液分装到塑料细管中，细管的一端塞有细线或棉花，其间放置少量聚乙烯醇粉（吸水后形成活塞），另一端封口，冷冻后保存。细管的长度约13cm，容量有0.25mL、0.5mL或1.0mL。现生产中牛的冻精多用0.25mL剂型。细管冻精具有不受污染、容易标记、易贮存、适于机械化生产等特点，是最理想的剂型。

（3）袋装冻精。马和猪输精量大，可用塑料袋分装，但目前冷冻效果不理想。

5.冻结

（1）干冰埋植法。适合于小规模生产及液氮缺乏地区。

①颗粒冷冻。把干冰置于木盒中，铺平压实，用预先做好的模板在干冰上压出直径0.5cm、深2～3cm的小孔，用滴管将平衡后的精液0.1mL左右滴入孔内，覆以干冰，2～4min后，收集冻精保存。

②细管冻精冷冻。将分装的冻精平铺于压实的干冰上，并迅速用冰覆盖，2～4min后取出贮存于干冰或液氮中。

（2）液氮法。

①颗粒冻精。在广口液氮桶上安装铜纱网，调至距液氮面1～3cm，预冷几分钟后，使纱网附近温度达-80～-100℃，将精液均匀地滴压在铜纱网上，2～4min后，待精液颗粒充分冻结、颜色变浅发亮时，用小铲轻轻铲下颗粒冻精，每50～100粒装入纱布袋中，沉入液氮保存。

②细管冻精。除按上述方法对细管进行熏蒸冷冻外，也可采用液氮浸泡法。把分装好的精液细管平铺于特制的细管架上，放入盛装液氮的液氮罐中浸泡，盖好，5min后取出保存。这种方法启动温度低，冷冻效果好。

（三）冻精的贮存

目前，冻精保存普遍采用液氮做冷源，以液氮罐为容器贮存和分发冻精。

1.液氮及其特性

液氮是空气中的氮气经分离、压缩形成的一种无色、无味、无毒的液体，沸点温度为-196℃。在常温下，液氮沸腾，吸收空气中的水汽形成白色烟雾。液氮具有很强的挥发性，当温度升至18℃时，其体积可膨胀680倍。此外，液氮又是不活泼的液体，渗透性差，无杀菌能力。

基于液氮的上述特性，使用时要注意防止冻伤、喷溅、窒息等，用氮量大时要保持空气通畅，注意保护。

2.液氮容器

液氮容器包括液氮贮运容器和冻精贮存容器，前者为贮藏和运输液氮用，后者为专门保存冻精用。当前冷冻精液专门使用的液氮罐型号较多，但其结构基本相同，如图5-17所示。

图5-17　液氮罐的构造

1—盖塞；2—分度圈；3—罐颈；4—手柄；5—真空排气口；6—吸附剂；7—内槽；8—夹尾；9—外壳；10—底座；11—提筒

（1）罐壁。由内外两层构成，一般由坚硬的合金制成。

（2）夹层。指内外壳之间的空隙。为增加罐的保温性，抽成真空。真空度为1.33×10^-4Pa，在夹层中装有活性碳、硅胶及镀铝绦纶薄膜等，以吸收漏入夹层的空气，也增加了罐的绝热性。

（3）罐颈。由高热阻材料制成，是连接罐体和罐壁的部分，较为坚固。

（4）罐塞。由绝热性好的塑料制成，具有固定提筒手柄和防止液氮过度挥发的功能。

（5）提筒。存放冻精的装置。提筒的手柄由绝热性良好的塑料制成，既能防止温度向液氮传导，又能避免取冻精时冻伤。提筒的底部有多个小孔，以便液氮渗入其中。

3.液氮容器使用应注意的问题

液氮容器主要是靠真空和减少导热来维持其冷藏性能，使用时应注意以下几点。

（1）使用前仔细检查外观，看是否有碰伤，然后倒入液氮检查其损耗情况。

（2）存放于阴凉、干燥、通风良好的室内，严禁靠近热源和放在室外日晒雨淋。

（3）使用过程中尽量避免碰撞、振动，严禁横放、叠放或倒置。

（4）存放液氮的容器要用瓶塞盖好，但瓶口不能密闭，以防爆炸。

（5）存放精液时要定期补充液氮，确保冻精浸入液氮中。

（6）取放冻精时，要尽量避免碰撞颈口。

（7）液氮罐要定期清洗，以免污染冻精。

四、各种动物精液的保存与运输

精液保存的目的是延长精子在体外的存活时间，便于长途运输，从而扩大精液的使用范围。精液保存的方法按保存温度不同，可分为常温保存、低温保存和冷冻保存三种。对于远距离购买精液的养殖场，运输过程至关重要，运输成败的关键在于保温和防震是否做得充分。将精液从甲地运往乙地，应如何运输?

（一）猪精液的保存与运输

1.精液的分装

精液稀释后需进行分装，通常按每头母猪一次的输精量进行灌装。精液分装常采用瓶装和袋装两种方式，装精液用的瓶和袋均为对精子无毒害作用的塑料制品。瓶装的精液分装简单方便，易于操作，瓶装的精液容量最高为100mL，袋装的精液分装一般需要专门的精液分装机，用机械分装、封口，袋装的精液容量一般为80mL。分装后的精液，要逐个粘贴标签，一般一个品种一个颜色，便于区分。分好后将精液瓶加盖密封，封口时尽量排出瓶中空气，贴上标签，标明猪的品种、耳号、采精日期、保存有效期、生产单位及相应的使用说明。

2.精液的保存

分装好的精液先置于22～25℃的环境下放置1～2h，然后移入16～18℃的恒温箱中保存。存放时，不论是瓶装的还是袋装的，均应平放，目的是增大精子沉淀后铺开的面积，减少沉淀的厚度，降低精子死亡的比率。

保存期内要注意三点：一是尽量减少恒温箱门的开关次数，防止频繁改变温度对精子的打击；二是每隔12h轻轻翻动一次（上下颠倒），以防精子沉淀。三是每天检查恒温箱内温度计的变化，防止温度出现明显波动，若出现停电应全面检查贮存的精液品质。精液保存时间的长短，因稀释液成分的不同而异，一般可保存2～3d。

3.精液的运输

精液运输是猪场人工授精顺利进行的必要环节，具有提高种公猪利用率、防止疾病传播、更新猪群血液等优点。

猪精液运输需注意以下几点。

（1）运输的精液需按规定进行稀释和保存，有详细的说明书，标明站名、公猪品种和编号、采精日期、精液剂量、稀释倍数、精子活率和密度等。

（2）精液包装要严密，不能发生泄露，运输多采用精液运输箱或广口保温瓶。

（3）尽量避免在运输过程中产生剧烈震荡和碰撞，可在输精瓶或输精袋周围放入碎的泡沫或气垫。

（4）精液运输过程中要注意保持温度的恒定。场内使用，可直接用厚棉垫包裹精液，放入泡沫箱进行运输。长距离运输时，可采用精液运输箱进行运输。

（5）精液运输过程中要防止阳光直射到泡沫箱上，更不能直射到输精瓶上。

（二）牛精液的保存与运输

1.精液的保存

目前，养牛生产中普遍采用液氮作冷源，液氮罐作为贮存冻精的容器。该法保存时间长，精液的使用不受时间、地域以及种公牛寿命的限制，对人工授精技术的推广及现代畜牧业的发展均具有十分重要的意义。

（1）液氮罐的使用。

①使用前要认真检查。新购或长期未用的液氮罐，必须外部无破损、无异常，内部干燥无异物，颈管和盖塞完全、贮精提筒完好，盛装液氮经过1d预冷并观察其损耗率，各项指标合格后方可使用。

②填充液氮时要小心谨慎，对于新液氮罐或处于干燥状态的液氮罐，一定要缓慢填充并进行预冷，以防降温太快损坏内胆，减少使用年限。或者将液氮运输罐的液氮经漏斗注入贮存罐内，为了防止液氮飞溅，可在漏斗内垫一块纱布。

③及时补充液氮。当液氮消耗掉1/2时，应立即补充液氮。液氮罐内液氮剩余量可用称量法来估算，也可用带刻度的木尺或细木条等插至罐底，经10s后取出，通过测量结霜的长度来估算。

④液氮罐需放置在阴凉、通风且干燥的室内，不得暴晒，不可横倒放置。

⑤做好定期的清洗和保养工作。每年应清洗一次罐内杂物，将空罐放置两天后，用40～50℃中性洗涤剂擦洗，再用清水多遍冲洗，干燥后方可使用。使用过程中，若发现罐的外壁结霜，说明罐的真空失灵，要尽快转移精液。

⑥防冻伤。液氮是一种超低温液体，若溅到皮肤上会引起类似烧伤一样的冻伤，因此在灌充和取出液氮时应注意自身的防护。

（2）精液的贮存。贮存精液时必须迅速放入经预冷的提筒内，浸入罐内液氮面以下，将提筒手柄置于罐口的槽沟内。

取用冻精时，操作要敏捷迅速，镊子在液氮罐口预冷，冻精不可提出液氮罐口，冻精脱离液氮的时间不得超过20s，注意不要摩擦颈管内壁，不可过分地弯曲提筒的手柄，取完后要迅速将冻精再次浸入液氮内，及时盖上罐塞，在向另一个液氮贮存罐内转移冷冻精液时，冻精在空气中转移时间不得超过5s，并迅速将精液再次浸入液氮内。

2.冷冻精液的运输

由冷冻精液站提供的冷冻精液必须经过精子活率抽检，检查种公牛品种、公牛号及数量，与标签一致无误后方可运输。盛装精液的液氮罐必须确保其保温性能，加外保护套或装入液氮罐运输箱内，液氮罐与液氮罐之间要用填充物隔开，在液氮罐底加防震软垫，防止颠簸撞击，严防倾倒，装卸车时要严防液氮罐碰击，不能在地上随意拖拉，以免损坏液氮罐，降低使用寿命。

（三）羊精液的保存与运输

1.精液的保存

目前，羊的精液多采用低温（0～5℃）保存。采精后应尽快完成精液的稀释，为防止精子的冷休克反应，应使用含有卵黄的稀释液，并进行缓慢降温，稀释倍数以2～4倍为宜。把稀释后的精液分装至贮精瓶中（羊的输精量小，可按10～20个输精剂量分装），封口，外包数层棉花或纱布，最外层用塑料袋扎好，防止水分渗入。把包装好的精液置于冰箱或广口保温瓶，从30℃缓慢降至0～5℃时，降温速度以每分钟下降0.2℃左右为宜，需1～2h完成降温过程。精液保存期间，尽量保持温度恒定。

2.精液的运输

若需要运输，可在广口保温瓶内放入冰块，把包装好的精液放在冰块上，盖好，注意定期添加冰源。在精液运输过程中，要注意避光，尽量减少震荡和碰撞。分装的小管和小瓶应装满，这样可以减少摇晃。运输包装应严密、防潮，同时应附有公羊品种编号、采精日期、精液剂量、稀释液种类、稀释倍数、精子活率和密度等详细说明书。若无冰源可采用化学致冷法，在冷水中加入一定量的氯化铵或尿素，可使水温达到0～5℃。

【实践】

根据本节的学习内容，由学生自行分配学习。

（1）精液的常温保存。

（2）精液低温保存。

（3）精液冷冻保存。

组织班上学生分成3个小组讨论，每个小组认真学习一个知识点，再从每个小组中选1名同学进行发言，交流所学知识点的主要内容，其他组的同学都可随机对发言者进行提问，由发言者及其组员共同回答和解决所提出的问题，以达到全班同学共同学习、共同掌握本节中所有知识点的目的。教师对各组同学的发言交流进行点评，并补充讲解遗漏的知识内容，最后，再进行学习评价及反思。

具体实施步骤如下。

第一步：各小组认真组织学习（20min）。

第二步：发言交流（20min）。

第三步：学生提问和回答（20min）。

第四步：教师总结和点评（10min）。

第五步：评价及反思（20min）。

本次实践考核分数组成：总分100分，其中理论知识掌握占50分，技能操作占50分。

将分数填入表5-6中。

表5-6　考核评价表