第二节　胚胎移植技术

胚胎移植（embryo transfer，ET）又称受精卵移植，俗称“借腹怀胎”。它是将体内、外生产的哺乳动物早期胚胎移植到同种的生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续发育成正常个体的生物技术。提供胚胎的雌性动物叫供体，接受胚胎的雌性动物称受体。

一、胚胎移植在畜牧生产上的意义

（一）充分发挥良种母畜的繁殖潜力以提高繁殖效率

一是使优良供体省去很长的怀孕期、缩短繁殖周期。二是实行超数排卵，一次可获得更多的优良胚胎，与提高优良公畜的配种效能的人工授精技术相对应；如一次可获得9头以上的犊牛、10头以上的羔羊。有效地缩短了优良母畜的繁殖周期，同时可产生更多的后代。

（二）缩短世代间隔以及早进行后裔测定

通过重复超数排卵，不断移植，使后代总数大大地增加，可及早地对后代进行后裔测定，胚胎移植育种已成为现代育种工作的有力手段。

（三）诱产双胎以提高生产效率

在肉牛业和肉羊业中，通过胚胎移植增加双胎率。不但提高了供体母畜的繁殖率，同时也提高了受体母畜的繁殖率，从而大大提高了生产效率。

（四）保存品种资源

胚胎长期保存是保存动物品种资源的理想方法，冷冻胚胎和冷冻精液共同构成动物优良性状的基因库。

（五）防止疾病传播

在养猪业中，采用胚胎移植技术代替剖腹取仔的方法可培育无特异病原体（SPE）猪群。

（六）使不孕母畜获得生育能力

对于不能妊娠的母畜，可以根据具体情况专门作为供体或受体，继续发挥其繁殖作用。

（七）促进基础理论研究

胚胎移植技术为动物繁殖生理学、生物化学、遗传学、细胞学、胚胎学、免疫学、动物育种学和进化学等学科开辟了新的试验研究途径。

（八）满足畜牧业现代化的需要

胚胎移植可以使优良母畜的繁殖效率接近或达到生物学最高限度，并且能够迅速改进家畜的品质。

牛的胚胎移植流程如图8-1所示。

图8-1　牛的胚胎移植流程

（a）用孕马血清促性腺激素对供体超排；
（b）超排处理后5d人工授精；
（c）人工授精后6～8d非手术收集胚胎；
（d）三路导管；
（e）胚胎检查和品质鉴定；
（f）向受体移植胚胎
1—手术法移植；2—非手术法移植

二、胚胎移植的生物学基础

（一）母畜发情后生殖器官的孕向发育

在母畜发情后，其生殖器官会经历一系列的变化。这些变化是为了准备接受受精卵的植入，包括子宫内膜的增厚、腺体的发育以及分泌物的增加。这些都是为了提供一个适宜的环境，以便胚胎能够成功着床和发育。

（二）早期胚胎的游离状态

在受精后的一段时间内，胚胎在母体的生殖道内是游离的，没有附着在子宫内膜上。这个时期，胚胎主要依靠自身的营养储备（如卵黄）来维持生长和发育。这种游离状态使得胚胎可以在没有与母体建立生理联系的情况下被收集和移植。

（三）胚胎移植与免疫排斥的影响

通常情况下，母体的免疫系统不会对移植的胚胎产生排斥反应。这是因为胚胎能够产生一些免疫抑制因子，或者母体的免疫系统在怀孕状态下对胚胎具有一定的耐受性，这种免疫耐受性是胚胎移植成功的关键因素之一。

（四）胚胎的遗传特性

胚胎移植的一个关键特点是，尽管胚胎在受体母畜的子宫内发育，但其遗传物质完全来自供体。这意味着，通过胚胎移植技术，可以保持供体动物的优良遗传特性，同时利用受体母畜的繁殖能力，从而加速遗传改良和品种繁育的进程。

三、胚胎移植的基本原则

（一）胚胎移植前后供体和受体所处环境的同一性

胚胎在移植前后应处于相似的环境中，以减少环境变化对胚胎造成的应激，包括温度、pH值、渗透压等条件。

（二）供体和受体在分类学上的相同属性

供体和受体应为同一物种。胚胎移植通常在同一物种内进行，以确保胚胎与受体的生理和免疫兼容性。

（三）生理上的一致性

供体和受体母畜应处于相同的生殖周期阶段，通常是同一时间发情，以确保受体的子宫环境适合胚胎着床。

（四）解剖部位的一致性

胚胎在移植前后所处的解剖位置应尽可能相似，以减少因解剖结构差异对胚胎造成的影响。

（五）胚胎收集的期限

胚胎的收集应在受体母畜周期黄体退化之前进行，通常在供体发情配种后3～8d收集，以确保胚胎的活力和移植的成功率。

（六）胚胎移植的时间

胚胎移植应在受体母畜的黄体功能期内进行，以利用黄体分泌的激素维持妊娠，通常在供体母畜发情后3～8d进行。

（七）胚胎质量的保证

只有高质量的胚胎才适合进行移植，以确保移植后的着床率和妊娠成功率。

胚胎在收集、储存、运输和移植的整个过程中都应避免受到物理、化学或生物因素的不良影响，以保持其活力和发育潜能。

四、胚胎移植基本程序

胚胎移植的过程，在各种家畜中基本相同，都是要经过供体、受体的选择，供体超排处理，受体同期发情处理，配种（输精），收集胚胎（采卵）和移植胚胎（移卵）等步骤，如图8-2所示。

图8-2　牛胚胎移植程序

（一）供体和受体的准备

1.供体的选择

（1）生产性能高，经济价值大，具备遗传优势，在育种上有价值。

（2）既往繁殖史正常，无遗传缺陷，具有良好的繁殖能力，且分娩顺利。

（3）体质健壮，膘情适度。

（4）必须是健康、具有较高的育种价值、生殖机能正常、对超排反应好的母畜。

2.受体的选择

受体可选本地品种，每头供体需要准备多头受体，要健康、繁殖性能良好，体型中等以上。

3.供体、受体的同期发情

供体、受体的发情时间相差不超过一天。

（二）供体超数排卵处理

超排技术通常用于单胎家畜，其目的是让优良母畜排出大量卵子，配种后提供更多的胚胎，充分发挥其繁殖潜力，是胚胎移植中的一个重要环节。

1.超排方法

（1）PMSG或FSH超排。给供体母畜注射PMSG或FSH，发情开始后12～16h和20～24h各配种（输精）一次，并于第一次配种后静脉注射hCG或LH，以便排出更多卵子。激素的应用时间和剂量因家畜种类不同而有差异。

（2）配合应用前列腺素（PG）。PG的用法通常是在应用PMSG以后大约48h进行肌注。牛的用量因PG种类而异，PGF_2α为30mg，15-甲基PGF_2α为2mg，氯前列烯醇为500µg；绵羊和山羊的用量为牛的一半。

（3）PMSG与抗PMSG配合使用。抗PMSG可以消除PMSG的残留作用，明显增加可用胚胎数，提高超排效果。

2.超排效果的评判标准

超排是胚胎移植中最难控制的一个环节，在实践中只要能使一半以上超排处理母畜达到满意结果，则认为超排是成功的。

（三）受体的同期发情

胚胎移植时，必须对受体进行同期发情处理，使受体母畜和供体的发情同期化，其发情时间差应控制在12h之内，若超过±24h（牛）或±48h（绵羊或山羊），则妊娠率急剧下降。

当前比较理想的同期发情药物是前列腺素及其类似物，其剂量因PG种类和用法不同而异。15-甲基PGF_2α2mg肌注，氯前列烯醇500µg肌注。

（四）供体的配种

1.本交

必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8～12h进行一次配种，直到发情结束。

2.人工授精

配种前应对种公畜的精液进行质量检查，需要精液密度大、活力高的精液输精。超排处理结束后，要密切观察供体的发情迹象。为确保卵子受精，一般在发情8～12h输精一次，以后间隔8～12h再输精一次，并且要加大输精量。

（五）胚胎采集

在配种或输精后适当时间，从超排供体回收胚胎，准备给受体移植的过程，称为胚胎采集或胚胎回收，简称采胚。

1.冲胚液和培养液的配制

现在多采用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），不但可用于冲洗、采集胚胎，还可用于体外培养、冷冻保存和解冻胚胎。

冲胚液的犊牛血清含量一般为3％（1％～5％），培养液血清含量为20％（1％～50％），犊牛血清需加热（56℃水浴30min）灭活。

2.采胚时间

根据配种时间、排卵的大致时间、胚胎的运行速度、胚胎的发育阶段、畜种、胚胎所处部位及采胚方法等因素来确定适宜的采胚时间。

3.采胚方法

采胚方法分为手术法和非手术法两种。手术法适用于绵羊、山羊、猪及实验动物；非手术法仅适用于牛、马等大家畜，且只能在胚胎进入子宫后进行。

（1）手术法采胚，如图8-3所示。手术法采胚的优点是胚胎收集率高；缺点是造成手术后的内脏器官的粘连，输卵管堵塞等后遗症。手术程序如下。

图8-3　手术法采胚

①母畜保定。一种方法是用全身或后躯麻醉后，将母畜进行仰卧保定。另一种方法是用局部麻醉，使母畜站立于六柱栏中保定。两者的保定姿势均为前低后高的方式。

②麻醉。全身麻醉可用普鲁卡因、酒精等；局部后躯麻醉用普鲁卡因、利多卡因进行腰荐或尾椎硬膜外腔注射，手术部位再以利多卡因作皮肤浸润麻醉。

③手术部位。母牛可在乳房至脐孔之间的白线上剖腹，切口长约10cm；羊在乳房左侧切口，切口长度4～6cm。

④采胚。主要包括输卵管冲胚法、子宫角冲胚法和输卵管－子宫角冲胚法三种。

⑤防止手术部粘连的几种方法。

·不要用金属器械挟持生殖器官。

·所用手套、棉花、纱布等术前要用生理盐水浸湿，以防黏附于生殖器官上。

·在生殖器官表面撒涂低浓度肝素液、樟脑油等，以防止其表面附着血或血凝块。

·缝合要牢固、紧密，防止术后发生疝症。

（2）非手术法采胚，如图8-4所示。适合于胚胎在子宫角内的大家畜，优点是不会对家畜造成伤害；缺点是胚胎收集率低。

图8-4　非手术法采胚

1—向气囊充气；2—注入冲卵液；3—硬膜麻醉；4—冲卵管在子宫内；5—子宫颈；6—接取含胚胎的冲卵液

由于手术法采胚在生产应用中受到限制，目前在马、牛等大家畜中都用采胚管进行非手术法采胚，一般在配种后7（6～8）d进行。

供体牛的保定和麻醉与手术法采胚相同，采胚时先用扩张棒对子宫颈进行扩张（青年牛尤为必要）；采胚管消毒后，将无菌不锈钢导杆插入采胚管内；将采胚管经子宫颈缓慢导入一侧子宫角基部，由助手抽出部分不锈导杆，操作者继续向前推进采胚管；当达到子宫角大弯附近时，助手从进气口注入12～25mL气体；当气囊位置和充气量合适时，抽出全部不锈钢导杆；助手用注射器吸取事先加温至37℃的冲胚液，从采胚管的进水口推进，进入子宫角内，再将冲胚液连同胚抽回注射器内，如此反复冲洗和回收5～6次；将每次回收的冲胚液收入集胚器内，并置于37℃的恒温箱或无菌检胚室内等待检胚；一侧子宫角冲胚结束后，按上边方法再冲洗另一侧子宫角。

（六）胚胎的检查

将收集到的冲卵液静置10min，等胚胎下沉后移去上层液体，直接吸取底部液体，置于实体显微镜下，在25～37℃的恒温条件下进行检查。在立体显微镜下，检查收集到的胚胎数，并用一细检胚吸管将胚胎移至新鲜培养液内，在放大40～200倍的复式显微镜下，进行形态学观察，选出适合移植的正常胚胎。

（七）胚胎培养和保存

1.常温保存

常温保存指在常温（15～25℃）下保存胚胎。通常采用含20％犊牛血清的PBS保存液，可保存胚胎4～8h。

2.低温保存

低温保存指在0～5℃的较低温度下保存胚胎的方法。在此温度下，胚胎细胞分裂暂停，新陈代谢速度显著减慢，所以较常温保存的存活时间要长。

3.冷冻保存

冷冻保存指在干冰（-79℃）和液氮（-196℃）中保存胚胎。胚胎冷冻方法有以下几种。

（1）逐步降温法。这是一种传统方法，本法的优点是解冻后胚胎存活率较高，但操作程序比较复杂。

（2）一步细管法。即在细管内用非渗透性蔗糖溶液一步脱除抗冻剂（甘油）的方法。其特点是从解冻到移植的全过程简单易行，利于在生产中推广应用。

（3）玻璃化法。用这种方法冷冻时，胚胎内外液体能同时玻璃化，不会形成冰晶，能较好地保护胚胎。

（八）胚胎移植

胚胎移植就是将采取的可用胚胎移给受体母畜，亦称卵的移植，简称移卵。

1.移胚部位

早期胚胎少于8细胞时，一般应移植于输卵管；多于8个细胞时，应移植于子宫角。

2.移胚方法

移胚方法与采胚方法相似，也分为手术法与非手术法两种，前者适用于不能进行直肠操作的中、小家畜，后者适用于大家畜。

（1）手术法移植。手术法移植与采胚方法相似，需要对母畜进行保定、麻醉。

以山羊为例，先在其乳房一侧作一平行于腹中线的切口，暴露输卵管和子宫角，再将胚胎注入输卵管或子宫角中。

无论是子宫内移植还是输卵管移植，都要避免注入空气。移植完毕后将输卵管及子宫角送回腹腔，按回收手术中的要求缝合腹壁创口，术后做好移植记录。

（2）非手术法移胚。非手术法移胚只适用于牛、马等大家畜，方法与输精相同只是部位深。

3.胚胎移植的原则

胚胎收集与移植的部位一致，且移植到有黄体一侧的子宫角或输卵管内。

4.供体和受体的术后观察

术后的供体和受体连续3d、2次/d注射青、链霉素；受体分群饲养；受体进行妊娠检查；加强营养水平。

5.影响胚胎移植妊娠率的因素

（1）胚胎因素。胚胎因素包括胚胎质量、日龄、移植胚胎的数量、提供胚胎的供体、胚胎在体外培养的时间、鲜胚和冻胚等。

（2）母体因素。母体因素包括供、受体发情同期化程度，受体的孕酮水平，受体的营养水平，受体子宫、卵巢的生理状况等。

（3）其他因素。其他因素包括自然发情与人工诱导发情，移植器污染程度以及操作者熟练程度等。

【实践】

根据本节的学习内容，由学生自行分配学习。

（1）胚胎移植的意义。

（2）胚胎移植的基本原则。

（3）胚胎移植技术。

将学生分成3个小组讨论，每个小组认真学习一个知识点，再从每个小组中选1名同学进行发言，交流所学知识点的主要内容，其他组的同学可随机对发言者进行提问，由发言者及其组员共同回答和解决所提出的问题，以达到全班同学共同学习、共同掌握本任务中所有知识点的目的。教师对各组同学的发言交流进行点评，并补充讲解遗漏的知识内容，最后，再进行学习评价及反思。

具体实施步骤如下。

第一步：各小组认真组织学习（20min）。

第二步：发言交流（20min）。

第三步：学生提问和回答（20min）。

第四步：教师总结和点评（15min）。

第五步：评价及反思（15min）。

本次实践考核分数组成：总分100分，其中理论知识掌握占50分，技能操作占50分。

将分数填入表8-2中。

表8-2　考核评价表